Sabtu, 12 Juni 2010

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan teknik untuk memisahkan molekul-molekul seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan kecepatan migrasi melewati gel elektroforesis. Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis (Lawrence 1989: 156).

Elektroforesis pertama kali dicetuskan oleh virologiwan yang bernama Vin Thorne dari Institut Virologi Glasgow. Thorne tertarik untuk menemukan cara yang paling efektif dalam analisis hasil amplifikasi DNA. Thorne beranggapan bahwa sumber listrik mampu memisahkan molekul-molekul DNA berdasarkan ukurannya. Hal tersebut didasarkan juga pada sifat DNA yang bemuatan negatif. Thorne berhasil memisahkan superhelical nicked dan bentuk linear dari DNA poliomavirus dengan menggunakan gel agar (Sambrook & Russell 2001: 52--53).

Elektroforesis memisahkan makromolekul berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel dibawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel akan memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk. 2002: 396--398).

Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan menganalisis pemanjangan primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis RNA pada ukuran standar
(Davis dkk. 1994: 151).

Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor sebagai berikut:

1. Ukuran molekul DNA

Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.

2. Konsentrasi gel

Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.

3. Bentuk molekul

Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel.

4. Densitas muatan

Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit volume molekul.

5. Pori-pori gel

Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel, sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA.

6. Voltase

Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.

7. Larutan buffer
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi DNA akan lebih cepat
(Wolfe 1993: 127).

Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA, dan protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda positif melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang menggunakan etidium bromida harus menggunakan sarung tangan (Schleif 1993: 26--29).

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil apmlifikasi. Marker DNA yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi molekul DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya (Martin 1996: 77).

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan berikut:

1. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom.
2. DNA fingerprinting.
3. Mendeteksi kelainan genetik.
4. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.
5. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen.
6. Mempelajari evolusi tingkat molecular.
7. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.
8. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu.
9. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.
10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid.
11. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR
(Russell 1994: 299--310 & 499--501; Fairbanks & Andersen 1999: 277--279).

Referensi:

Birren, B. & E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide.
Academic Press, Inc., San Diego: xviii + 235 hlm.

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Ed ke-5. Terj. dari Biology oleh Lestari, R, dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.

Fairbanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. 4th ed. Wadsworth Publishing Company, London: xix + 820 hlm.

Lawrence, E. 1989. Henderson’s dictionary of biological terms. 10th ed. John Will & Sons, New York: ix + 637 hlm.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford: xvi + 175 hlm.

Sambrook, J. & D. W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual vol 2. 3rd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York: xvii + 3.4--14.53 + 1.44

Schleif, R. 1993. Molecular and cellular biology. Wadsworth Inc., Belmont: xviii + 1145 hlm.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.

---------------------------------------------------------------------
MUSTOFA ABI HAMID
BPH Masjid Al-Wasi’i Unila
Jl.Sumantri Brojonegoro no.13 Gedung Meneng PostCode:35145
Bandar Lampung - Indonesia
Phone: (0721) 783044.
HP. : 0857.6837.3366
e-mail: abi.sma4@gmail.com
abi.unila@yahoo.co.id
website: www.mustofaabihamid.blogspot.com

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar